隨著社會經濟的沙棘鼠急伤快速發展，人們的甾醇作用生活水平不斷提高，生活方式發生了較為深刻的性乙變化。人們飲酒量的醇型需求也在日益增加。與此同時，胃黏酒精引起的膜损消化係統問題越來越受到關注。因此，保护尋找具有保護胃黏膜功能的研究生物活性物質已成為人類關注的熱點之一。沙棘甾醇是沙棘鼠急伤沙棘油中的天然活性成分之一，是甾醇作用植物生長過程中重要的次生代謝產物，具有多種藥理活性功能。性乙本實驗以沙棘籽油為樣品，醇型采用皂化法提取樣品中的胃黏甾醇並對工藝進行優化，經無水乙醇反複重結晶得到純化沙棘甾醇，膜损采用磷硫鐵顯色法測定甾醇含量(總甾醇含量為84.5％)，保护參考文獻並稍作修改。研究了沙棘甾醇對大鼠急性乙醇型胃黏膜損傷的生化指標和病理學影響，初步闡述了沙棘甾醇對乙醇型胃黏膜損傷的保護作用。

一、材料

1、動物

SPF級SD大鼠112隻，雌雄各半，體重160±15g，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心，實驗動物許可證號SCXK(陝)2017-003。大鼠自由進食水，明暗周期12h，室溫22-25℃，相對濕度40％～60％。適應周期為7d。

2、藥品

采用皂化法提取沙棘籽油甾醇並對工藝進行優化，得出最佳皂化工藝條件，經氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)檢測鑒定，沙棘籽油甾醇種類有菜油甾醇、△7-燕麥甾烯醇、β-穀甾醇、△5-燕麥甾烯醇4種；40℃烘幹備用。

實驗鼠維持飼料：江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司；鹽酸雷尼替丁膠囊(湖北民康製藥有限公司，規格：0.15g／粒，國藥準字：H42021353)；烏拉坦(Adamas試劑有限公司，生產貨號：51-79-6)。

3、試劑

SOD、MDA、GSH-Px試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TNF-a、MTL、PEG2、HEX-β、cAMP試劑盒(武漢優爾生科技股份有限公司)；橄欖油(天津嘉裏糧油有限公司，生產日期：B20171123X)、0.9％生理鹽水(山東齊都藥業有限公司)、75％乙醇(天津市富宇精細化工有限公司)。

4、儀器

酶標儀(美國ThermoFisher公司)、台式高速離心機(德國艾本德公司)、數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)、加熱磁力攪拌器(德國IKA公司)。

二、方法

1、供試物製備

沙棘甾醇和鹽酸雷尼替丁膠囊在灌胃給藥前，研磨成粉後溶解(懸浮)於橄欖油中，通過加熱磁力攪拌器和超聲處理獲取均質的溶液。

2、實驗分組、造模和給藥

實驗前對各組大鼠進行稱量、標號並記錄。將大鼠按體重隨機分為正常對照組、模型對照組、橄欖油對照組、鹽酸雷尼替丁組、沙棘甾醇低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組16隻，雌雄各半。對照組及模型組灌胃生理鹽水，橄欖油組灌胃橄欖油，其餘各組按鹽酸雷尼替丁組(50mg·kg^-1·d^-1)、沙棘甾醇低劑量組(100mg·kg^-1·d^-1)、沙棘甾醇中劑量組(200mg·kg^-1·d^-1)和沙棘甾醇高劑量組(400mg·kg^-1·d^-1)給藥。灌胃容積為10mL／kg，每日灌胃1次，連續給藥7d。實驗前一天禁食不禁水24h。末次空腹給藥2h後，除正常對照組外，其餘各組灌胃75％乙醇製備急性胃黏膜損傷模型，各治療組用藥劑量根據成人量換算動物劑量倍數簡表計算得出。

三、檢測指標

1、胃組織形態及病理學檢查

造模2h後，每組隨機選取2隻大鼠，20％烏拉坦腹腔注射麻醉。打開大鼠腹腔，結紮幽門與賁門，取出全胃，用PBS緩衝液衝洗胃內雜質，剪取大鼠胃組織(0.5cm×O.5cm)置於2.5％戊二醛溶液中做電鏡檢查。經固定、組織脫水、浸透包埋，製備半薄切片，在透射電鏡下，甲苯胺藍染色、定位，在10000倍下觀察，隨機CCD相機采集照片。

2、樣品采集

每組剩餘14隻大鼠均打開腹腔，取出全胃，結紮幽門與賁門，組織置於-80℃儲存，用於相關指標的測定。橫切一塊胃組織，在冷生理鹽水中漂洗，去除血液，濾紙吸幹，稱重；在加入9倍體積的PBS磷酸緩衝鹽溶液，組織勻漿機10000-15000ffmin上下進行研磨，待溶液中無纖維狀物質即為勻漿完全，3000r／min離心10min，取上清，即為10％胃組織勻漿液。

3、胃組織抗氧化指標測定

利用BCA法測定大鼠胃組織中蛋白的含量。黃嘌呤氧化酶法測定大鼠胃組織中SOD酶活力，采用SOD測定試劑盒(微量法)。取大鼠胃組織勻漿18μL，依次按步驟加入試劑盒中的試劑，充分混勻，室溫靜置30min，於560nm處測OD值，計算各組大鼠胃組織中SOD酶活性。

硫代巴比妥酸法測定大鼠胃組織中MDA含量，采用MDA試劑盒。取待測胃組織勻漿200μL於96孔板中，依次加入試劑盒中的試劑，旋渦混勻器混勻，95℃水浴中保溫30min，置於冰浴中冷卻，1000×g，25℃，離心10min；測定532nm和600nm處的吸光度，記為A532和A600，△A=A532-A600，計算各組大鼠胃組織中MDA含量。

DTNB法測定大鼠胃組織中GSH—Px酶活性，采用GSH-Px試劑盒。取待測胃組勻漿0.2mL，依次加入試劑盒中的試劑，混勻，1700×g，離心10min，取上清液lmL做顯色反應，顯色反應結束後，室溫靜置15min，412nm處測得OD值，計算各組大鼠胃組織中GSH-Px酶活力。

4、胃組織中TNF-a、PGE2、HEX-β、cAMP含量的測定

采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測大鼠胃組織勻漿中TNF-a、PGE2、cAMP、HEX-β的含量；取待測勻漿，按試劑盒加樣於96孔板，37℃孵育1小時，吸棄，加檢測溶液A，37℃孵育lh，洗板3次，加檢測溶液B，37℃孵育30min，洗板5次，加TMB底物，37℃孵育15min，加終止液，讀取OD值。

5、數據統計分析

采用SPSS17.0軟件進行統計學處理及分析，以均數±標準差(±S)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，P＜0.05為有顯著差異。

四、結果與分析

1、沙棘甾醇對急性損傷大鼠胃組織形態的影響

取胃組織進行大體形態觀察，結果顯示，對照組大鼠胃組織結構完整，大小、形態正常，胃黏膜清潔。模型對照組表現出明顯的黏膜損傷，出現黑褐色的出血點。沙棘甾醇中、高劑量組和雷尼替丁組的胃黏膜損傷程度與模型組比較均有不同程度的減輕，其中以高劑量效果最好。結果見圖1。

2、沙棘甾醇對急性損傷大鼠胃組織病理學的影響

如圖2所示，正常對照組大鼠胃黏膜細胞結構清晰，細胞核圓形，核內染色質分布基本均勻；細胞質內線粒體豐富、脊短小，細胞內可見較多堆疊排列的粗麵內質網。模型對照組，胃黏膜壁細胞及主細胞明顯腫脹，壁細胞數量增多、體積較大、核內常染色質稀疏、線粒體腫脹，部分線粒體脊溶解、消失，粗麵內質網減少。陽性藥物鹽酸雷尼替丁組胃黏膜壁細胞及主細胞結果清晰，壁細胞輕度腫脹，細胞核圓形，核內染色質輕度凝集；細胞質內線粒體豐富，輕度腫脹。

沙棘甾醇各劑量組隨著劑量的增加，胃黏膜壁細胞及主細胞結構逐漸趨於正常，細胞腫脹度減輕，細胞核形狀漸轉規則，核內染色質均勻，線粒體腫脹逐步減輕，粗麵內質網豐富。
 

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