根據10批便可通片的指紋圖譜檢測結果,共標出16個共有峰,高效樣品峰經與對照品比較分析,液相研究指認出5個共有成分,指纹指标其中2號峰為鬆果菊苷,及多4號峰為柚皮苷,成分5號峰為新橙皮苷,定量9號峰為蘆薈苷,分析15號峰為蘆薈大黃素,通片图谱見圖2。高效9號峰分離度較好,液相研究峰麵積也比較穩定,指纹指标故選擇此峰作為參照峰。及多
將10批樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜分別導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價係統”(2004A版)軟件進行相似度評價。成分結果10批便可通片相似度在0.971~0.999之間,定量表明相似度良好,結果見表3。
分別取便可通組方中的各單味藥材適量,精密稱定,按“2.2.2”項下方法製備藥材樣品溶液。分別精密吸取供試品溶液和各單味藥材樣品溶液各10μL進樣,注入高效液相色譜儀,記錄100min色譜圖。對保留時間保持一致的色譜峰進行分析比較,根據紫外光譜信息,對全方與藥材指紋圖譜的相關峰進行指認,確認共有峰的藥材歸屬,見圖3。
確認了便可通片HPLC指紋圖譜中16個特征峰的來源,其中2、3號峰來自肉蓯蓉,3號峰來自生地黃,3號峰來自玄參,4、5、7號峰來自枳實,1、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16號峰來自蘆薈,16號峰來自當歸,16號峰來自決明子。火麻仁、桃仁成分多為末端吸收,在該色譜條件下基本無響應,故在樣品中未進行共有峰標記。
精密吸取“2.2.1”項下製備的對照品溶液適量,分別加入流動相(或甲醇)稀釋成係列質量濃度的對照品溶液進行測定,進樣10μL,測定其峰麵積,以質量濃度(X)為橫坐標,峰麵積(Y)為縱坐標繪製標準曲線,進行線性回歸,得回歸方程。結果見表4。
精密稱量已知蘆薈苷、柚皮苷、新橙皮苷、鬆果菊苷含量的樣品(S1)0.5g,共6份;分別精密加入蘆薈苷對照品8.1mg,柚皮苷對照品7.9mg,新橙皮苷對照品8.6mg,鬆果菊苷對照品溶液(0.5196mg·mL-1)3.5mL,即1.8mg;置50mL棕色量瓶中,按照“2.2.2”項下操作,即得。按“2.1”項下色譜條件進行分析,結果蘆薈苷、柚皮苷、新橙皮苷、鬆果菊苷的平均加樣回收率分別為101.62%、99.52%、102.05%和98.35%,RSD分別為2.01%、1.95%、2.21%和2.84%,表明本方法對各成分的加樣回收率符合要求。
取10批便可通片樣品適量,精密稱定,按“2.2.2”項下製備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進行分析。結果見表5。
本研究考察了便可通片不同提取方式(超聲提取、加熱回流提取),不同提取溶劑(乙醇、水、甲醇、50%甲醇)的提取效果,結果表明以甲醇超聲提取效果最佳。
本研究采用DAD檢測器全波長掃描的方式,參考處方各單味藥材有效成分的檢測波長,提取出200、220、235、260、280、300nm等波長下的圖譜進行比較,結果發現在300nm下,樣品色譜圖呈現的色譜峰數目多,且響應值較高。同時考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%冰醋酸水、甲醇-0.2%冰醋酸水4種流動相係統,發現采用甲醇-0.1%冰醋酸水流動相係統,參照峰(蘆薈苷)峰型較好,分離度、對稱因子和理論塔板數均較好。
本研究對便可通片全方與藥材指紋圖譜的相關峰進行指認,確認了5個峰的物質成分,主要來自肉蓯蓉、枳實、蘆薈。肉蓯蓉中發揮改善腸胃功能的藥效物質基礎為苯乙醇苷類化合物,其中鬆果菊苷能緩解便溏和便血,促進受損腸道肌層表皮細胞的增殖和減少炎性浸潤。枳實中柚皮苷、新橙皮苷等黃酮類成分,可改善功能性消化不良大鼠的胃排空和小腸推進;蘆薈含有蘆薈苷等蒽醌成分,具有瀉下通便的功效,故本研究選擇鬆果菊苷、柚皮苷、新橙皮苷、蘆薈苷4種成分進行定量測定。含量測定結果表明,便可通片10批樣品中鬆果菊苷、蘆薈苷含量變化較大。本研究發現,蘆薈苷對照品(甲醇溶解)放置較長時間後會降解成2個峰,分別對應樣品中8、9號峰。亦有文獻報道蘆薈苷大部分是蘆薈苷A和蘆薈苷B兩個光學異構體的混合體,其對照品峰麵積的改變直接影響樣品中蘆薈苷含量的計算。故本實驗對蘆薈苷對照品的配置進行研究,分別用甲醇、流動相溶解,考察0、2、4、6h蘆薈苷降解率。結果表明,蘆薈苷在流動相混合溶液中較甲醇溶液中更為穩定。因此,選擇蘆薈苷作為質控指標尤為重要。
本研究建立了10批便可通片的指紋圖譜,采用指紋圖譜軟件共標定出16個共有峰,相似度均大於0.95,說明所建立的指紋圖譜具有較好的可控性,可為便可通片的質量評價提供依據。方法學試驗表明該色譜方法可同時定量分析蘆薈苷、柚皮苷、新橙皮苷、鬆果菊苷的含量。采用上述建立的HPLC指紋圖譜方法,可同時對便可通片藥材、飲片與成品進行指紋圖譜檢測和有效成分含量測定,實現終端質控向生產過程質量控製過渡,以提升產品質量,穩定產品品質,為便可通片的上市生產奠定了基礎。
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